Biologische Nanoporen als Biosensoren und elektrische Schaltelemente

Elektrophysiologische Einzelmolekül-Meßmethoden, die für Biosensoren verwendet werden, basieren auf dem Coulter-Prinzip; es werden einzelne Moleküle mittels eines Spannungsgradienten durch nanoskalige Poren getrieben, welche aus Proteinen oder Festkörpermaterialien bestehen. Makromoleküle nahe der oder innerhalb der Pore verändern dabei den Fluss kleiner Elektrolytionen durch die Pore, und daraus können Details über die Chemie der translozierten Moleküle abgeleitet werden. Für Biosensor-Anwendungen sind insbesondere Proteinporen attraktiv, da ihre Porengrößen an eine Reihe biologisch wichtiger Zielmoleküle angepasst sind. Darüber hinaus erlauben es molekulargenetische Methoden („Protein Engineering“), Porenproteine zielgerichtet zu verändern und mit den gewünschten Funktionalitäten zu versehen.

Hier berichten wir über die Fortschritte im Bereich des de novo-(Designs von transmembranen beta-barrel-Poren für stochastische Biosensor-Applikationen. Wir habe hierbei zwei komplementäre Ansätze verfolgt, um solche Poren zu produzieren: einmal, indem wir Fragmente bekannter Porenproteine rekombiniert haben, um Poren variabler Größe zu erhalten (Bausteinansatz), und zweitens, indem wir existierenden Proteinporen mittels Punktmutationen modifiziert haben, mit dem Ziel, ihre Stabilität zu erhöhen und ihre Leitfähigkeit zu modulieren (Optimierungsansatz). Unser Bausteinansatz basiert auf der Erkenntnis, dass es uns zum Beispiel die Genduplikation des bakteriellen, achtsträngigen beta-barrel-Proteins OmpX und die Rekombination seiner Fragmente erlaubt, Porenproteine fast beliebiger Größe herzustellen. Für unseren Optimierungsansatz haben wir Varianten eines eukaryotischen Porenproteins (Tom40) mit modifizierten und optimierten strukturellen Eigenschaften erzeugt. Hierbei nutzen wir ein Modell der physikalischen Interaktionen, um schwach stabilisierte beta-Stränge in der Transmembrandomäne des Proteins zu identifizieren und das Protein dadurch gezielt mittels Punktmutationen zu verändern. Es gelang uns dadurch, die Resistenz des Proteins gegen chemische und thermische Denaturierung zu erhöhen. Die Rekombination von Bausteinen in Kombination mit Punktmutationen zur Stabilisierung ist auch in Fällen möglich, in denen keine Proteinstruktur bei atomarer Auflösung und nur begrenzte biophysikalische Daten vorliegen. Solche „Protein Engineering“-Ansätze ermöglichen die Produktion stabiler und leicht anpassbarer Proteine für Biosensor-Anwendungen.